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分子生物学工具酶 >RobustScript III First-Strand cDNA Synthesis Kit
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#M0401

50 次

1,000.00元

#M0402

250 次

4,000.00元

 
概述:

RobustScript III第一链cDNA合成试剂盒采用RobustScript III反转录酶合成第一链cDNA。RobustScript III反转录酶是基因工程改造后的M-MLV反转录酶(莫洛尼氏鼠白血病病毒pol基因),降低了RNase H活性,增强了热稳定性(最高反应温度55°C),具有更好的特异性和产量。RobustScript III反转录酶可合成cDNA的最高长度达12 kb。

第一链cDNA的合成:
 

1. 将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中:

oligo(dT)12-18(500 μg/mL)* 1 μl
总RNA / mRNA 10 pg-5 μg/10 pg-500 ng
dNTP Mix(各10 mM) 1 μl
RNase-free Water 至13 μl

*注:也可以使用50-250 ng随机引物或2 pmole基因特异性引物

2. 混合物在65°C加热5分钟后,迅速置于冰上。加入:

5× 第一链合成缓冲液 4 μl
0.1 M DTT 1 μl
RNase抑制剂(40 U/μl) 1 μl
RobustScript III反转录酶 1 μl

3. 混匀组分,如果使用的是随机引物,应在25°C下孵育5分钟。
4. 50°C孵育30-60分钟,如果使用基因特异性引物、复杂模板或富含二级结构的模板需将反应温度增加到55°C。
5. 70°C加热15分钟以终止反应。

 
推荐PCR反应体系和程序:
 

1. 在PCR反应管中加入下列成分:

10× PCR缓冲液 5 μl
dNTP Mix(各10mM) 1 μl
上游扩增引物 (10 μM) 1 μl
下游扩增引物 (10 μM) 1 μl
Taq DNA聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl
cDNA (来自于第一链合成反应) 2 μl
灭菌蒸馏水 至50 μl

2. 变性: 94°C加热2分钟。
3. 退火和延伸条件需要根据目标片段长度等设定。进行15-40个PCR循环。

 
注意事项:
 

使用适宜存放在冰盒或冰浴上,使用完毕后立即放置于-20°C保存。

文档下载

RobustScript III第一链cDNA合成试剂盒.pdf(如无法打开,请使用“右键另存为”保存说明书。)

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